El microscopio de contraste de fases

Para observar .microrganismos vivos con el microscopio óptico no se puede utilizar azul de metileno ni otros colorantes porque los microrganismos no sobrevivirían al teñirlos. Por eso se utliza el microscopio de contraste de fases.

Cuando la luz de iluminación del microscopio atraviesa el microrganismo, ya que éste es transparente pero con un índice de refracción diferente del del medio por el que se propaga la luz, se produce un desfase del frente de onda de la luz que atraviesa el microrganismo en su camino hacia el objetivo, respecto de la luz que va hacia el objetivo sin atravesar por el microrcganismo. Este desfase se produce porque la velocidad de la luz depende del índice de refracción del medio por el que se propague.

V = c / n 

Donde V es la velocidad de la luz en un medio, c es la velocidad de la luz en el vacío, n es el índice de refracción del medio.

Por lo tanto, como el índice de refracción del microrganismo transparente es mayor que el índice de refracción del medio en el que está inmerso el microrganismo, el frente de onda de la luz que atraviesa el microrganismo tiene un desfase,

D = (nmicrorganismo/ nmedio) d - d

Donde d es la distancia recorrida por la luz por dentro del microrganismo.
Donde D es el desfase el unidades de longitud.

Δ= 2π ((nmicrorganismo/ nmedio)-1) (d / λ)
Donde Δ es el desfase en radianes. Para un microrganismo con λ de unos 500 nanómetros (longitud de onda de la luz de iluminación) Δ= π/2 radianes.

El microscopio de contraste de fases tiene un diafragma que sólo permite que salga un haz de corona circular de luz desde la fuente de iluminación, este haz atraviesa la lente condensadora y a continuación atraviesa la preparación en la que está inmerso el microrganismo. A partir de ahí, se propaga el frente de ondas del haz que no atraviesa el microrganismo, no retardado, en paralelo al frente de onda retardado π/2 radianes del haz que atraviesa el microrganismo. A continuación, ambos haces atraviesan una lámina con corona circular que causa un retardo de π/2 radianes en el haz que no atravesó el microrganismo, de esta manera ambos haces se ponen en fase e interfieren constructivamente, con lo cual aumenta el brillo del haz que atravesó el microrganismo. A continuación, ambos haces atraviesan otra lámina con corona circular que oscurece el haz que no atravesó el microrganismo. Se obtiene así una imagen brillante del microrganismo en el plano focal del objetivo.